鸡蛋中氯霉素残留量的测定,酶联免疫吸附测定

2019-09-27 20:45 来源:未知

目 次前言.................................................................................. II1 范围................................................................................. 12 规范性引用文件....................................................................... 13 制样................................................................................. 14 测定方法............................................................................. 15 检测方法灵敏度、准确度、精密度....................................................... 3前 言为了加强食品安全检测,保障人民群众的身体健康和生命安全,有效监测牛奶中的氨苄青霉素残留,我们建立了《牛奶中氨苄青霉素残留检测方法—酶联免疫吸附测定法(ELISA)法》本标准按GB/T1.1—2000 《标准的结构和编写规则》进行编制,GB/T 1.2-2000《标准化工作导则 第2部分:标准中规范性技术要素内容的确定方法》进行修改。本标准由四川省畜牧食品局提出并归口。本标准由四川省质量技术监督局批准发布。本标准起草单位:四川省兽药监察所、四川省兽药残留监控中心。本标准主要起草人:程江、彭莉、岳秀英、熊浩山、官艳丽、王海波、吴晓岚。牛奶中氨苄青霉素残留检测方法-酶联免疫吸附测定(ELISA)法1 范围本标准规定了牛奶中氨苄青霉素残留量检测的制样和酶联免疫吸附测定法。本标准适用于牛奶中氨苄青霉素的残留量的快速筛选检测。本方法的最低检出限为10.0μg/L。对于可疑样品需用确证法确认。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件,其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准。GB/T 6682-1992分析实验室用水规则和试验方法3 制样3.1 样品的制备取适量新鲜的空白或供试牛奶,涡旋混合使之均匀,密封。3.2 样品的保存-20℃以下冰箱中贮存备用。4 测定方法4.1 方法提要或原理将供试牛奶中的杂质用试剂沉淀后,取上清液以酶联免疫吸附测定法测定氨苄青霉素药物残留,其基本原理是抗原抗体反应。酶标板的微孔包被有偶联抗原,标样或样品中的氨苄青霉素和微孔条上预包被的偶连抗原竞争青霉素特异性抗体。通过洗涤除去没有与特异性抗体结合的酶标记抗原。加入底物液,结合到板上的酶标记物将底物转化为有色产物。加入终止液,在450nm处测定吸光度值,吸光度值与试样中氨苄青霉素浓度呈反比。4.2 试剂和材料以下所用的试剂,除特别注明者外均为分析纯试剂;水为符合GB/T 6682规定的二级水。4.2.1 0.36M亚硝基铁氰化钠溶液的配制 称取二水合亚硝基铁氰化钠(Na2Fe(CN)5.NO.2H2O) 10.7g用水溶解定容至100mL即可。4.2.2 1M 硫酸锌溶液的配制称取七水合硫酸锌(ZnSO4.7H2O) 28.8g用水溶解定容至100mL即可。4.2.3 氨苄青霉素试剂盒(采用官方备案的试剂盒)氨苄青霉素系列标准溶液 **0mg/mL 、0.2mg/mL、0.6mg/ml、1.8mg/mL、5.4mg/mL、16.2mg/mL4.2.4 酶标板 **8条×12孔,包被有偶联抗原4.2.5 酶标二抗4.2.6 氨苄青霉素抗体工作液4.2.7 底物溶液A4.2.8 底物溶液B4.2.9 浓缩洗涤液临用前用水稀释二十倍作为洗涤液4.2.10 浓缩复溶液 临用前用水1:1稀释。4.2.11 终止溶液4.3 仪器和设备4.3.1 酶标仪(配备450nm滤光片)4.3.2 天平感量0.01g4.3.3 分析天平 感量0.00001g4.3.4 漩涡混合器4.3.5 振荡器4.3.6 冷冻离心机4.3.7 离心管20mL4.3.8 微量移液器 **单道20mL,50mL,100mL,1000mL;多道50-250mL4.4 测定步骤4.4.1 试料的制备试料的制备包括:——取混匀后的供试样品,作为供试试料。——取混匀后的空白样品,作为空白试料。——取混匀后空白样品,添加适宜浓度的标准溶液,作为空白添加试料。4.4.2 提取和净化4.4.3 精密量取2mL试料于离心管中,精密加入0.36M亚硝基铁氰化钠溶液50mL,充分混合后加入1M 硫酸锌溶液50mL,涡动1min,于6000r/min 15℃离心10min,取出上层液体20mL和已稀释的复溶液380mL充分混合,取50mL用于分析。4.4.4 样品测定程序(20℃~26℃条件下操作)4.4.4.1 使用前将试剂盒置于室温(20~26℃)平衡30min以上,注意每种液体试剂使用前均须摇匀。取出需要数量的酶标板微孔条插入框架中,将不用的微孔条放入自封袋,保存于2~8℃。将样品和标准品对应微孔按序编号,每个样品和标准品均需做两个平行实验。4.4.4.2 加入50mL标准溶液或试样溶液到微孔底部,每孔再加入50mL氨苄青霉素抗体溶液,轻轻振荡混匀,用盖板膜封板,25℃避光环境中反应30min。4.4.4.3 倒出孔中液体,将酶标板倒置在吸水纸上拍打,去除孔中液体。每孔加入250mL洗涤液,10s后倒出孔中液体,用吸水纸拍干,如此重复操作共洗板5次。4.4.4.4 加入100mL酶标二抗到微孔底部,用盖板膜封板,25℃避光环境中反应30min。取出酶标板,如前述洗板5次。4.4.4.5 加入50mL底物溶液A和50mL底物溶液B到微孔中,轻轻振荡混匀25℃避光环境显色15min。4.4.4.6 加入50mL终止液到微孔中,轻轻振荡混匀,设定酶标仪于450nm处,测定每孔吸光度值(OD值)。4.5 结果计算和表述所获得的标准或样品吸光度值的平均值除以第一个标准(0标准)吸光度值的平均值再乘以100%,得到以百分比给出的吸光度值,以式(1.1)表示:百分吸光度值= ×100%………………………………………………1.1式中:B—为标准溶液或供试样品的平均吸光度值;B0—为零浓度标准溶液的平均吸光度值。以X轴为标准溶液中氨苄青霉素浓度(mg/L)的自然对数,Y轴为百分吸光度值,在半对数坐标纸上绘制标准曲线图。相对应的供试样品的浓度(mg/L)可以从标准曲线上查出。也可以求出回归曲线的方程,计算未知样品中氨苄青霉素的浓度。如果有专业计算机软件可直接求出供试样中氨苄青霉素的浓度。注:检测结果小于10.0μg/L时,可判为未检出,大于10.0μg/ L时,判为可疑,需用确证法确认。5 检测方法灵敏度、准确度、精密度5.1 灵敏度本方法在牛奶中的最低检测限为1.60μg/L,最低检出限为10.0μg/L。5.2 准确度本方法在牛奶中10.0μg/L~50.0μg/L添加浓度的回收率为70.0%-110.0%。5.3 精密度![](file:///C:/DOCUME~1/lenovo/LOCALS~1/Temp/msohtml1/01/clip_image001.gif)本方法的批内变异系数CV≤14.0%;批间变异系数CV≤11.0%。**

目 次前言.................................................................................. II1 范围................................................................................. 12 规范性引用文件....................................................................... 13 制样................................................................................. 14 测定方法............................................................................. 15 检测方法灵敏度、准确度、精密度....................................................... 3前 言为了加强食品安全检测,保障人民群众的身体健康和生命安全,有效监测猪肉中的青霉素残留,我们建立了《猪肉中青霉素残留检测方法—酶联免疫吸附测定法(ELISA)法》。本标准按GB/T1.1—2000 《标准的结构和编写规则》进行编制,GB/T 1.2-2000《标准化工作导则 第2部分:标准中规范性技术要素内容的确定方法》进行修改。本标准由四川省畜牧食品局提出并归口。本标准由四川省质量技术监督局批准发布。本标准起草单位:四川省兽药残留监控中心、四川省兽药监察所。本标准主要起草人:杨松沛、彭莉、岳秀英、熊浩山、官艳丽、王海波、吴晓岚。猪肉中青霉素残留量检测方法-酶联免疫吸附测定(ELISA)法1 范围本标准规定了猪肉中青霉素残留量检测的制样和酶联免疫吸附测定法。本标准适用于猪肉中青霉素的残留量的快速筛选检测。本方法在猪肉中的最低检出限为4.0μg/ Kg。对于可疑样品需用确证法确认。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件,其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准。GB/T 6682-1992分析实验室用水规则和试验方法3 制样3.1 样品的制备取适量新鲜的空白或供试猪肉,绞碎匀浆使之均匀,密封。3.2 样品的保存-20℃以下冰箱中贮存备用。4 测定方法4.1 方法提要或原理猪肉中残留的青霉素用乙腈- 0.1M NaOH溶液提取,酶联免疫吸附测定法测定,其基本原理是抗原抗体反应。酶标板的微孔包被有偶联抗原,标样或样品中的青霉素与酶标记抗原竞争青霉素特异性抗体。通过洗涤除去没有与特异性抗体结合的酶标记抗原。加入底物液,结合到板上的酶标记物将底物转化为有色产物。加入终止液,在450nm处测定吸光度值,吸光度值与试样中青霉素浓度呈反比。4.2 试剂和材料以下所用的试剂,除特别注明者外均为分析纯试剂;水为符合GB/T 6682规定的二级水。4.2.1 0.1M NaOH溶液:称取0.4gNaOH,加入去离子水100mL溶解。4.2.2 乙腈- 0.1M NaOH溶液的配制:取乙腈84mL,加入0.1M NaOH溶液16mL混合均匀。4.2.3 青霉素试剂盒(采用官方备案的试剂盒)4.2.3.1 青霉素系列标准溶液 365bet手机app下载,0mg/mL 、0.1mg/mL、0.3mg/ml、0.9mg/mL、2.7mg/mL、8.1mg/mL4.2.3.2 酶标板8条×12孔,包被有偶联抗原4.2.3.3 酶标记物4.2.3.4 青霉素抗体4.2.3.5 底物溶液A4.2.3.6 底物溶液B4.2.3.7 浓缩洗涤液临用前用水稀释二十倍作为洗涤液4.2.3.8 终止溶液4.3 仪器和设备4.3.1 酶标仪(配备450nm滤光片)4.3.2 天平感量0.01g4.3.3 分析天平 感量0.00001g4.3.4 漩涡混合器4.3.5 振荡器4.3.6 组织匀浆机4.3.7 冷冻离心机4.3.8 氮吹仪4.3.9 离心管20mL4.3.10 微量移液器 单道20mL,50mL,100mL,1000mL;多道50~250mL4.4 测定步骤4.4.1 试料的制备试料的制备包括:——取混匀后的供试样品,作为供试试料。——取混匀后的空白样品,作为空白试料。——取混匀后空白样品,添加适宜浓度的标准溶液,作为空白添加试料。4.4.2 提取和净化精密称取2g试料于离心管中,加入8mL乙腈- 0.1M NaOH溶液(V/V 84:16),涡旋2 min,振荡20min,室温6000r /min离心10min,取出1mL上层液体在氮气流下50~60℃干燥,加入1mL正己烷溶解干燥的残留物,再加1mL稀释后的复溶液充分混匀,室温6000r /min离心5min,去除上层正己烷相,下层水相按1:4体积比进行稀释(50mL样本液+200mL稀释后的复溶液),取50mL用于分析。4.4.3 样品测定程序(20℃~26℃条件下操作)4.4.3.1 使用前将试剂盒置于室温(20℃~26℃)平衡30min以上,注意每种液体试剂使用前均须摇匀。取出需要数量的酶标板微孔条插入框架中,将不用的微孔条放入自封袋,保存于2℃~8℃。将样品和标准品对应微孔按序编号,每个样品和标准品均需做两个平行实验。4.4.3.2 加入50 mL标准溶液或试样溶液到微孔底部,每孔再加入50mL青霉素抗体溶液,轻轻振荡混匀,用盖板膜封板,37℃环境中反应30min。4.4.3.3 倒出孔中液体,将酶标板倒置在吸水纸上拍打,去除孔中液体。每孔加入250mL洗涤液,10s后倒出孔中液体,用吸水纸拍干,如此重复操作共洗板5次。4.4.3.4 加入100mL酶标记物到微孔底部,用盖板膜封板,37℃环境中反应30min。取出酶标板,如前述洗板5次。4.4.3.5 加入50mL底物溶液A和50mL底物溶液B到微孔中,轻轻振荡混匀37℃环境避光显色15min。4.4.3.6 加入50mL终止液到微孔中,轻轻振荡混匀,设定酶标仪于450nm处,测定每孔吸光度值(OD值)。4.5 结果计算和表述**

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百分吸光度值= ×100%…………………………………………………1.1式中:B—为标准溶液或供试样品的平均吸光度值;B0—为零浓度标准溶液的平均吸光度值。以X轴为标准溶液中青霉素浓度(mg/L)的自然对数,Y轴为百分吸光度值,在半对数坐标纸上绘制标准曲线图。相对应的供试样品的浓度(mg/L)可以从标准曲线上查出。也可以求出回归曲线的方程,计算未知样品中青霉素的浓度。如果有专业计算机软件可直接求出供试样中青霉素的浓度。注:检测结果小于50μg/Kg时,可判为符合规定,大于50μg/Kg时,判为可疑,需用确证法确认。5 检测方法灵敏度、准确度、精密度5.1 灵敏度本方法在猪肉中的最低检测限为1.0μg/Kg,最低检出限为4.0μg/ Kg5.2 准确度本方法在猪肉中4.0μg/Kg~50.0μg/Kg添加浓度的回收率为60.0%~120.0%。5.3 精密度![](file:///C:/DOCUME~1/lenovo/LOCALS~1/Temp/msohtml1/01/clip_image001.gif)本方法的批内变异系数CV≤21%;批间变异系数CV≤32%。

定性离子对365bet手机app投注,(m/z)

所获得的标准或样品吸光度值的平均值除以第一个标准(0标准)吸光度值的平均值再乘以100%,得到以百分比给出的吸光度值,以式(1.1)表示:

药物

B —— B0

4.5.3 测定法取试样溶液和相应的对照溶液,做标准曲线校准,按内标法以峰面积计算,即得。空白试样、对照溶液和试样溶液中各特征离子的质量色谱图分别见附录A4.5.4 空白试验4.6 结果计算随行标准曲线制备:计算A321>152/A326>157峰面积比值,标准曲线校准。由标准曲线方程![](file:///C:/DOCUME~1/lenovo/LOCALS~1/Temp/msohtml1/01/clip_image002.jpg)求得a和b,则![](file:///C:/DOCUME~1/lenovo/LOCALS~1/Temp/msohtml1/01/clip_image004.jpg)然后按下式计算供试组织中氯霉素残留量:![](file:///C:/DOCUME~1/lenovo/LOCALS~1/Temp/msohtml1/01/clip_image006.jpg)式中:As——对照溶液中氯霉素的峰面积;A¢is——对照溶液中内标的峰面积;cs——对照溶液中氯霉素标准品的浓度(mg/L);c¢is——对照品中氯霉素内标的浓度(mg/L);c——供试溶液中氯霉素浓度(mg/L);cis——供试溶液中氯霉素内标的浓度(mg/L);A——试样溶液中氯霉素的峰面积;Ais——试样溶液中氯霉素内标的峰面积;X——试料中氯霉素的残留量(mg/kg);V——溶解残留物所用溶液体积(L);m——组织样品的质量(kg)5 检测方法灵敏度、准确度和精密度5.1 灵敏度氯霉素在鸡蛋中的检测限为0.05μg/kg,定量限为0.2μg/kg。5.2 准确度本方法在0.2mg/kg~ 1.0mg/kg添加浓度的回收率为50%~120%。5.3 精密度本方法的批内变异系数≤6%,批间变异系数≤5%。

氘代氯霉素

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氯霉素(CAP)

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目 次前言.................................................................................. II1 范围................................................................................. 12 规范性引用文件....................................................................... 13 制样................................................................................. 14 测定方法............................................................................. 15 检测方法灵敏度、准确度和精密度....................................................... 4附录A (资料性附录) 氯霉素特征离子质量色谱图、特征离子质谱图......................... 5前 言进的检测方法即高效液相色谱-串联质谱法来作为检测手段,使其定量限满足欧盟要求,以加强控制鸡蛋中氯霉素的残留,保证鸡蛋的质量安全,维护广大消费者的切身利益。最终研究建立了《鸡蛋中氯霉素残留量的检测方法—高效液相色谱-串联质谱LC-MS-MS法》本标准按GB/T1.1—2000 《标准的结构和编写规则》进行编制,GB/T 1.2-2000《标准化工作导则 第2部分:标准中规范性技术要素内容的确定方法》进行修改。本标准附录A是资料性附录。本标准由四川省畜牧食品局提出并归口。本标准由四川省质量技术监督局批准发布。本标准起草单位:四川省兽药监察所、四川省兽药残留监控中心。本标准主要起草人:彭莉、岳秀英、熊浩山、官艳丽、王海波、吴晓岚鸡蛋中氯霉素残留量的测定-高效液相色谱-串联质谱(LC-MS-MS)法1 范围本标准规定了鸡蛋中氯霉素残留检测的制样和高效液相色谱-串联质谱(LC-MS-MS)测定方法。本标准适用于鸡蛋中氯霉素残留量的测定。定量限为0.2μg/kg。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件,其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准。GB/T 6682-1992分析实验室用水规则和试验方法3 制样3.1 样品的制备取适量新鲜或恢复至室温的空白和供试去壳全蛋,匀浆使之均匀,密封。3.2 样品的保存-20°C以下贮存备用。4 测定方法4.1 方法提要或原理经乙腈-水溶液提取,正己烷去脂,乙酸乙酯重复提取,C18固相萃取柱净化后,用高效液相色谱-串联质谱仪测定,氘代氯霉素内标法定量。4.2 试剂和材料以下所用试剂,除特别注明者外均为分析纯,水为符合GB/T6682规定的二级水。4.2.1 氯霉素含氯霉素(C11H12Cl2N2O5)不得少于98%4.2.2 氘代氯霉素含氘代氯霉素(C11H7D5Cl2N2O5)不少于98.5%4.2.3 乙腈色谱纯4.2.4 甲醇色谱纯4.2.5 盐酸4.2.6 乙酸乙酯4.2.7 正己烷4.2.8 0.1mol/L 盐酸溶液4.2.9 (84+16)乙腈-水溶液4.2.10 (5+95)乙腈-水溶液4.2.11 (50+50)乙腈-水溶液4.2.12 氯霉素标准储备液 取氯霉素约10mg,精密称定,置100mL 量瓶中,用甲醇溶解并稀释成浓度为100mg/mL氯霉素标准储备液。置-20℃保存,保存期不超过1年。4.2.13 氯霉素内标储备液取100mg/mL氘代氯霉素,精密量取,置100mL 量瓶中,用甲醇溶解并稀释成浓度为1mg/mL氯霉素内标储备液。置-20℃保存,保存期不超过6个月。4.2.14 氯霉素标准工作液 准确取适量氯霉素标准储备液,用流动相稀释成适宜浓度的氯霉素标准工作液。-20℃以下保存,有效期不超过3个月。4.2.15 20ng/mL氯霉素内标工作液 准确取适量氯霉素内标储备液,用流动相稀释成含氘代氯霉素为20ng/mL的内标工作液。-20℃以下保存,有效期不超过3个月。4.2.16 C18固相萃取柱(500mg/3mL)4.3 仪器和设备4.3.1 高效液相色谱-串联质谱仪(配电喷雾离子源)4.3.2 天平 感量0.01g4.3.3 分析天平 感量0.00001g4.3.4 涡旋振荡器4.3.5 组织匀浆器4.3.6 冷冻离心机4.3.7 样品浓缩仪4.3.8 固相萃取装置4.3.9 离心管 10mL,50mL4.3.10 微孔滤膜 0.22mm4.4 测定步骤4.4.1 试料的制备试料的制备包括:——取匀浆后的供试样品,作为供试材料。——取匀浆后的空白样品,作为空白材料。——取匀浆后的空白样品,添加适宜浓度的标准溶液作为空白添加试料。4.4.2 提取称取(5±0.05)g试料,置于50mL离心管中,精密加入20ng/mL氘代氯霉素内标工作溶液500mL,然后加入0.1mol/L 盐酸溶液1mL,(84+16)乙腈-水溶液8mL溶液,混合震荡5min,以5000rpm离心10min。重复一次,合并两次提取液于另一50mL离心管中。加正己烷8mL,涡旋振荡5min,5000rpm离心5min,弃上清液,重复一次。然后再加乙酸乙酯5mL,涡旋振荡5min,6000rpm离心5min,取上清液于鸡心瓶中,重复一次,合并两次提取液,50°C下减压蒸干。用(5+95)乙腈-水溶液3mL溶解残留物,备用。4.4.3 净化固相萃取柱依次用甲醇10mL,水10mL预洗活化,取备用液过柱,保持流速在1mL/min左右洗脱。用水4mL洗柱,然后用(50+50)乙腈-水溶液4mL将样品洗脱至离心管中。洗脱液中加乙酸乙酯4mL,涡旋振荡1min,5000rpm离心5min,取上清液,重复提取一次,合并提取液,氮气下吹干。用(50+50)乙腈-水溶液1mL溶解残留物,涡旋过0.22mm滤膜后供高效液相色谱-串联质谱测定。4.4.4 标准曲线的制备精密量取氯霉素标准工作液和氘代氯霉素内标工作液适量,用流动相稀释成氯霉素浓度分别为0.5 、1.0、2.0、5.0、10.0mg/L, 氘代氯霉素内标浓度为10.0 mg/L的工作液供高效液相色谱-串联质谱测定。4.5 测定4.5.1 液相色谱条件色谱仪:Waters 2695高效液相色谱仪或相当者色谱柱:AtlantisTMC18 (2.1mm×150mm,5μm) 或相当者柱温:30℃流速:0.2mL/min进样量:20μL运行时间:8min流动相:乙腈+水(50+50)4.5.2 质谱条件质谱仪:Waters Quattro Premier XE或相当者电离模式:ESI-扫描方式:负离子扫描检测方式:多反应检测电离电压:2.8KV源温:120℃雾化温度:350℃锥孔气流速:50L/h;雾化气流速:450L/h;数据采集窗口:8min驻留时间:0.2sec定性、定量离子及对应的锥孔电压和碰撞电压见表1表1 氯霉素定性、定量离子对和锥孔电压及碰撞电压

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18

321/152

定量离子对(m/z)

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锥孔电压(V)

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碰撞电压(V)

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